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  • 凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)

    凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)

    實驗方法原理凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一技術*初用于研究DNA結合蛋白,目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時,依據目的RNA結合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RN**段和寡核苷酸片段(特異), 和其它非相關的片段(非特異),來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。實驗材料DNA樣品試劑、試劑盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶緩沖液醋酸銨TE無水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺甘油過硫酸銨TEMED(四甲基乙二胺)EMSA Gel-Shift結合緩沖液溴酚藍儀器、耗材水浴鍋PCR儀離心機電泳儀電泳槽實驗步驟一、探針的標記 1.   如下設置探針標記的反應體系: (1)待標記探針 (1.75 pmol/微升) :2微升。 (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1微升。 (3)Nuclease-Free Water :5微升。 (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1微升。 (5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1微升。 (6)總體積 10微升 (7)按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻。 2.   使用水浴或PCR儀,37℃反應10分鐘。 3.   加入1微升探針標記終止液,混勻,終止探針標記反應。 4.   再加入89微升TE,混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標記效率。 5.  標記好的探針**立即使用,*長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。 二、 探針的純化 通常為實驗簡便起見,可以不必純化標記好的探針。在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結果。如需純化,可以按照如 下步驟操作: 1.  對于100微升標記好的探針,加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻。 2.   在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過夜。 3.  在4℃,12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清,切不可觸及沉。 4.   在4℃,12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀,但不宜過分干燥。 5.   加入100微升TE,完全溶解沉淀。標記好的探針**立即使用,*長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在 -20℃。 三、EMSA 膠的配制 1.   準備好倒膠的模具??梢允褂贸R幍墓嘀频鞍纂娪灸z的模具,或其它適當的模具。**選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續操作。為得到更好的結果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。 2.   按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。 (1)TBE buffer (10X): 1毫升。 重蒸水 16.2毫升。 (2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2毫升。 (3)80% 甘油: 625微升。 (4)10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) :150微升。 (5)TEMED :10微升 3.  按照上述次序加入各個溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡, 并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。 四、EMSA結合反應 1.   如下設置EMSA結合反應 陰性對照反應: (1)Nuclease-Free Water :7微升。 (2)EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) :2微升。 (3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子: 0微升。 (4)標記好的探針 :1微升。 (5)總體積 :10微升。 樣品反應: (1)Nuclease-Free Water :5微升。 (2)EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) :2微升。 (3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子 :2微升。 (4)標記好的探針: 1微升。 (5)總體積: 10微升。 探針冷競爭反應: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) :2微升。 (3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子: 2微升。 (4)未標記的探針: 1微升。 (5)標記好的探針: 1微升。 (6)總體積 :10微升。 突變探針的冷競爭反應: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) :2微升。 (3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子 :2微升。 (4)未標記的突變探針: 1微升。 (5)標記好的探針: 1微升。 (6)體積 :10微升 Super-shift反應: (1)Nuclease-Free Water:4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) :2微升。 (3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子:2微升。 (4)目的蛋白特異抗體 :1微升。 (5)標記好的探針:1微升。 (6)總體積 :10微升。 2.   按照上述順序依次加入各種試劑,在加入標記好的探針前先混勻,并且室溫(20-25℃)放置10分鐘,從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合,或者讓冷探針優先反應。然后加入標記好的探針,混勻,室溫(20-25℃)放置20分鐘。 3.   加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色,10X),混勻后立即上樣。注意:有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合,建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液,至能觀察到藍顏色即可。 五、 電泳分析 1.  用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色),以觀察電壓是否正常進行。 2.   把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色),用于觀察電泳進行的情況。 3.   按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳。 4.   剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注:通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板),把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘),輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。 5.  干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測。
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